Propuesta de procedimientos operativos estándar para el funcionamiento eficiente de un cepario de hongos
Proposal for standard operating procedures for the efficient operation of a mushroom strain collection
Yolexis Roberta Cardona Soberaoa; Roxana Suárez Rodrígueza; Amaury Pérez Sáncheza, *
a Facultad de Ciencias Aplicadas, Universidad de Camagüey, Carretera Circunvalación Norte, km. 5 ½, e/ Camino Viejo de Nuevitas y Avenida Ignacio Agramonte, CP 74650, Camagüey, Cuba.
* Autor corresponsal: Amaury Pérez Sánchez [ amaury.perez84@gmail.com | https://orcid.org/0000-0002-0819-6760 ]
Yolexis Roberta Cardona Soberao [ yolexis.cardona@reduc.edu.cu | https://orcid.org/0000-0002-0042-5805 ]
Roxana Suárez Rodríguez [ roxana.suarez@reduc.edu.cu | https://orcid.org/0009-0009-0928-6790 ]
Resumen
En la presente investigación se hace una propuesta de procedimientos operativos estándar que deban implementarse para el funcionamiento eficiente de un cepario de hongos, tomando como posible aplicación a la Universidad de Camagüey. A través de una revisión exhaustiva de la literatura existente, y un análisis de las prácticas actuales sobre manejo de ceparios, se desarrollaron directrices específicas que abordan los materiales y el equipamiento necesario para la construcción del cepario, así como el costo de las mismas, el personal calificado con el que debe contar para su adecuado funcionamiento, la preparación de medios de cultivos, así como también el almacenamiento y registro de datos. El objetivo principal es diseñar la estructura documental de los procedimientos operativos estándar del cepario de hongos de la universidad de Camagüey, y, de esta manera, facilitar el acceso a cepas de hongos de alta calidad para desarrollar una investigación científica de excelencia. Los procedimientos propuestos incluyen un objetivo, alcance, fundamentos, materiales, equipos, descripción y responsable, con el fin de evitar la contaminación y contribuir a la excelencia en la investigación micótica del futuro cepario a construirse en la Universidad de Camagüey.
Palabras clave: Cepario; procedimientos; cepas; hongos comestibles.
Abstract
In this research, a proposal is made for standard operating procedures that should be implemented for the efficient operation of a mushroom strain collection, taking as a possible application the University of Camagüey. Through an exhaustive review of the existing literature, and an analysis of the current practices on strain collection management, specific guidelines were developed that address the materials and equipment necessary for the construction of the strain collection, as well as their cost, the qualified personnel that must be available for its proper operation, the preparation of culture media, as well as the storage and recording of data. The main objective is to design the documentary structure of the standard operating procedures of the mushroom strain collection at the University of Camagüey, and, accordingly, facilitate access to high-quality mushroom strains to develop scientific research of excellence. The proposed procedures include an objective, scope, foundations, materials, equipment, description and person responsible, in order to avoid contamination and contribute to excellence in mushroom research of the future strain collection to be built at the University of Camagüey.
Keywords: Strain collection; procedures; strains; edible mushrooms.
1. Introducción
La conservación de la naturaleza debe ser una acción consciente y enfocada a la subsistencia de la especie humana y de su calidad de vida, en tanto la pérdida de biodiversidad no solo afecta a la productividad de los ecosistemas, sino que está generando altera-ciones sociales y culturales importantes, relacionadas con el aprovechamiento y disfrute que el ser humano realiza del medio natural.
La preservación de las especies es una disciplina que intenta remediar el declive de las especies ante la ocupación del territorio, la monopolización de los recursos y la alteración de los ecosistemas por parte del ser humano (Tellería, 2012).
El hongo ostra (Pleurotus ostreatus) es uno de los hongos más fácilmente cultivables en el mundo. Es reconocido tanto por su amplio rango de compa-tibilidad con el sustrato como por su sabor suave característico a ostra cuando se cocina, siendo tanto comestible como delicioso (Urgesa et al., 2024).
En Grimm et al. (2024) se reporta que el hongo ostra es la segunda especie de hongo más cultivada en el mundo, abarcando alrededor del 19% del mercado. El hongo ostra gris (Pleurotus ostreatus) se encuentra entre las especies de setas más versátiles y robustas, ya que puede cultivarse en un rango extenso de residuos agrícolas sin la necesidad de llevar a cabo la esterilización completa del sustrato.
Las setas comestibles pueden considerarse como un recurso natural cultivable por lo tanto renovable. Su cultivo, producción y consumo deben fomentarse adecuadamente entre la población por las institu-ciones tanto de investigación como de vinculación y asesoría, generando el material biológico o inóculo adecuado en cuanto a su viabilidad y eficiencia, así como la tecnología económica y accesible que garantice la adopción y manejo adecuado de la misma por los productores (Cardona et al., 2022).
Según Urgesa et al. (2024), el cultivo de setas comes-tibles es una de las ramas avanzadas de la biotec-nología microbiana actual con el fin de favorecer el suministro de nutrientes y la aplicación medicinal, así como también para el reciclaje de residuos orgánicos lignocelulósicos.
Las setas comestibles han sido investigadas y evalua-das extensivamente en los últimos años por diferen-tes autores. Jamil et al. (2019) se evaluaron la idonei-dad de tres sustratos fácilmente disponibles en Paquistán (paja de trigo, papel de periódico y agujas de pino) para el crecimiento de tres especies dife-rentes de setas comestibles, las cuales fueron P. sajor-caju, P. sapidus y P. eryngii. Patel et al. (2019) evaluaron el comportamiento del crecimiento, el parámetro de esporóforos y potencial de rendimien-to de cinco especies de Pleurotus, a saber: P. sajor-caju, P. florida, P. flabellatus, P. eryngii y P. ostreatus. Hussein et al. (2019) estudiaron los mejores residuos agrícolas para obtener una mejor calidad de crecimiento de micelio de Pleurotus ostreatus y el mejor completamiento para la degradación en un corto período de tiempo, siendo los residuos estudiados la paja de trigo, paja de cebada y el Jacinto de agua (Echhoria crassipes). Tesfay et al. (2020) evaluaron la idoneidad de cultivar Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kummer en residuos de papel suplementados con tallo de maíz y afrecho de trigo. Cruz et al. (2020) estudiaron el cultivo de Pleurotus ostreatus artesanalmente sin un riguroso control automatizado de temperatura y humedad, optimi-zando el uso de varios residuos agroindustriales: cascarilla de arroz (Oriza sativa L.), cascarilla de café (Coffea arabica L.) y aserrín (partículas de la madera aserrada), como sustratos en la producción de esta especie y se determinaron la tasa de producción, eficiencia biológica, y el porcentaje de proteína. Karmani et al. (2022) analizaron la influencia de seis sustratos lignocelulósicos diferentes (paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, mazorca de maíz, aserrín de madera blanda y de madera dura, y aserrín general) en el crecimiento y composición nutricional de la seta P. ostreatus. Akter et al. (2022) evaluaron el cultivo de Pleurotus ostreatus en cinco residuos agrícolas: paja de arroz, paja de trigo, mazorcas de maíz, aserrín/cascarilla de arroz en proporción 3:1 y bagazo de caña de azúcar. Grimm et al. (2021) exploraron alternativas de utilizar residuos de la industria papelera (fibra de celulosa), como sustrato para el cultivo de Pleurotus ostreatus, se muestrea-ron tres sustratos con 40, 60 y 80% m/m de fibra y una fórmula de sustrato convencional basada en aserrín de abedul (Betula ssp.) para comparación. Por último, Werghemmi et al. (2022) evaluaron la influencia de extractos de hojas de aceituna y té verde, en el diámetro de crecimiento micelial y tasa de crecimiento lineal de Pleurotus ostreatus var. a temperaturas de inoculación de 22, 25 y 28 °C.
En Cuba se reportan varios estudios relacionados con el cultivo de setas comestibles. García et al. (2007) cultivaron seis cepas de Pleurotus spp. (cinco de P. ostreatus y una de P. sajor-caju) sobre pulpa de café como sustrato en un sistema de fermentación sólida, con el fin de producir enzima lacasa y evaluar además la disminución de los compuestos tóxicos tales como fenoles totales y cafeína presentes en dicho sustrato. García et al. (2011) evaluaron la influencia de las formulaciones de sustratos a base de pulpa de café, con viruta de madera, cáscaras de cacao y coco en la producción de setas comestibles (dos cepas de Pleurotus ostreatus) mediante la aplicación de fermentación en estado sólido. También, en García et al. (2016) evaluaron la actividad lacasa de tres cepas: Pleurotus ostreatus CCEBI 3021, Pleurotus ostreatus, var. Florida CCEBI 3024 y Pleurotus sajor-caju CCEBI 3027, cultivadas sobre pulpa de café. La determi-nación de la actividad lacasa se realizó en las fases de inóculo y colonización. Asimismo, Ferrer et al. (2019) realizaron un estudio cinético de la extracción de compuestos fenólicos a partir de la biomasa micelial de Pleurotus ostreatus, obtenida mediante fermenta-ción sumergida. Igualmente, Beltrán et al. (2020) compilaron los procedimientos para la producción de las setas comestibles del género Pleurotus, con aplicaciones potenciales desde el punto de vista farmacológico. En otro estudio, Bermúdez et al. (2001) cultivaron Pleurotus ostreatus f. spp. Florida (P-184) en varios residuos agrícolas tales como pulpa de café, cáscara de cacao y cáscara de coco, los cuales fueron procesados mediante secado solar, almacenados, pasteurizados y usados para el cultivo de este hongo comestible. Bermúdez et al. (2018) evaluaron la productividad de dos cepas de Pleurotus, utilizando dos tipos de biorreactores: en bolsas y en bandeja, empleando como sustrato la pulpa de café Coffea canephora Pierre ex Frhoener. De la misma forma, Pérez et al. (2020) evaluaron el cultivo de Pleurotus ostreatus (cepa P969) sobre paja de arroz, observándose un crecimiento micelial robusto a los 21 días de incubación, en condiciones de oscuridad total y temperatura 27 °C. Puig et al. (2020) evaluaron la cascarilla de arroz y el afrecho cervecero como sustratos puros para el cultivo del Pleurotus ostreatus, empleando la pulpa de café como referencia, siendo los parámetros estudiados: eficiencia biológica, rendimiento, diámetro de los cuerpos fructíferos y precocidad. Cardona et al. (2022) validaron el proceso de secado y rehidratación de la seta P. ostreatus, a diferentes temperaturas (40, 50 y 60 °C) con el fin de rehidratar las setas deshidratadas, utilizando sustrato de cascarilla de arroz hidrolizado. Cardona et al. (2022) definieron los medios de cultivo referidos por la literatura para la proliferación del género Pleurotus de setas comesti-bles y valorar su aplicación en las condiciones de Cuba. Cardona et al. (2023) elaboraron un procedi-miento para la producción, conservación, y manteni-miento de la cepa del género Pleurotus ostreatus, que permita llevar a cabo, de forma práctica, estas operaciones de la manera más eficiente posible. Bermúdez et al. (2021) evaluaron el sustrato remanente (SRS) del cultivo de Pleurotus spp. en la producción de plántulas de Carica papaya Lin., variedad Maradol Roja en condiciones de cultivos semiprotegidos, empleándose semillas de papaya certificadas y los sustratos secos: SRS, humus de lombriz y la combinación de ambos. Por último, Suárez et al. (2024) plantearon una metodología para la producción eficiente de inóculos en el cultivo de setas comestibles Pleurotus spp, a partir de cuatro tipos de granos (arroz con cáscara, maíz, cebada y aserrín), con el fin de mejorar la eficiencia y productividad en la producción de estas setas.
En la actualidad las setas de Pleurotus se conservan en la Universidad de Camagüey sin existir los procedimientos específicos para ello, por tanto, la implementación de un cepario en el que se manten-gan las mismas de forma eficiente, controlada y efectiva constituye una necesidad y desafío. De esta manera, es un reto para el Departamento de Ciencia y Tecnología de los Alimentos de la Universidad de Camagüey investigar esta temática en particular. La construcción de un cepario en la Universidad de Camagüey forma parte de una tarea del proyecto: "Desarrollo de tecnologías para la producción de alimentos a partir de setas comestibles en la cadena agroalimentaria" perteneciente al Programa Territo-rial de Alimento Humano: Producción sostenible de alimentos con encadenamiento productivo, en la provincia de Camagüey, Cuba.
En este contexto, en el presente trabajo se propone, mediante una revisión bibliográfica exhaustiva, los requisitos indispensables para la confección de un futuro cepario en la Universidad de Camagüey, así como también la elaboración de los procedimientos operativos estándar del futuro cepario de hongos, con el objetivo de mantener las cepas en un laboratorio de forma eficiente y efectiva, asegurando su viabilidad a lo largo del tiempo y contribuyendo así a su mantenimiento y conservación.
2. Metodología
Se realizó una investigación documental con enfoque descriptivo en los laboratorios de la Facultad de Ciencias Aplicadas de la Universidad de Camagüey, durante el período de mayo a julio del curso académico 2024. El estudio se centró en la elaboración de Procedimientos Operativos Estándar (POE) para su implementación en el cepario de hongos comestibles, como parte de la tarea II: "Metodología para el cultivo de setas comestibles a partir de residuos agroindustriales del territorio", del proyecto territorial "Desarrollo de tecnologías para la producción de alimentos a partir de setas comestibles en la cadena agroalimentaria de la Universidad de Camagüey".
Se realizó una búsqueda exhaustiva de literatura relevante utilizando bases de datos y buscadores académicos, así como la consulta de libros, tesis doctorales, normas, patentes e informes técnicos. Los términos clave empleados en la búsqueda fueron: cepario, procedimientos, microorganismos, hongos, cepas y formulación. Se incluyeron documentos en inglés y español, publicados en los últimos 10 años, que fueran pertinentes a los objetivos del estudio.
2.4. Encuesta
Se realizó una encuesta a informantes claves en conservación de hongos. La encuesta se llevó a cabo a través de un cuestionario estructurado, permi-tiendo la recolección de datos de los expertos. Se utilizaron técnicas de análisis cualitativo para obtener información profunda y detallada.
Se revisaron casos de estudio de ceparios en otras instituciones, extrayendo prácticas y procedimientos efectivos que pudieran ser adaptados al contexto del cepario de la Universidad de Camagüey.
Se siguió el siguiente procedimiento:
Revisión y validación de los POE:
a) Se realizó una revisión interna por pares (mínimo dos revisores).
b) Se implementó un período de prueba del POE (2-4 semanas).
c) Se recopiló retroalimentación de los operadores durante el período de prueba.
d) Se realizaron ajustes basados en la retroalimen-tación y las observaciones.
Validación por expertos:
a) Se seleccionó un panel de expertos (mínimo tres) en micología y gestión de laboratorios.
b) Se utilizó el método Delphi para la validación, que incluyó:
Aprobación y documentación final:
a) Se incorporaron todas las modificaciones acorda-das.
b) Se obtuvo la aprobación formal de la dirección del laboratorio.
c) Se asignó un número único de identificación al POE.
d) Se registró en el sistema de gestión de documen-tos del laboratorio.
Los datos recolectados se compilaron y organizaron sistemáticamente. Se realizó un análisis cualitativo de la información recolectada. Finalmente, se llevó a cabo una síntesis de hallazgos y se elaboraron recomendaciones basadas en los resultados obtenidos.
3. Resultados y discusión
No existe un consenso nacional o mundial respecto a cómo un cepario en un laboratorio de investigación debería ser organizado, que requerimientos de alma-cenamiento o documentos de trabajo se debe tener. Existen solo guías de diferentes laboratorios, y recomendaciones de entidades administradores de calidad como la ISO, cada una con sus propias metodologías y métodos de control de calidad (Rojas, 2018). Una colección de cultivos, por definición, corresponde a un espacio físico destinado a la preservación de microorganismos, por tanto, debe poseer un lugar para la instalación de múltiples unidades funcionales donde se lleven a cabo diferentes procesos para cumplir con las actividades de preservación y curatoría propias de una colección de cultivos.
Un cepario debe tener:
El personal del cepario (Tabla 1) debe tener una estructura organizacional clara y con objetivos de trabajo definidos.
Tabla 1
Personal del cepario y sus funciones
Cargo | Función |
Curador | Es el encargado de la colección de cultivos y de planificar, desarrollar y dirigir líneas de investigación y de manejo del cepario. Tiene comunicación directa con los depositantes y con todo el personal. |
Gestor técnico | Se encarga principalmente de la operatividad de las actividades técnicas asociadas al manejo de las colecciones microbianas preservadas en una colección de cultivos. Debe de ser el interlocutor entre el personal técnico y el curador. |
Técnico | Es el personal que se encarga de ejecutar las actividades técnicas del laboratorio siguiendo procedimientos establecidos para el adecuado manejo del material genético preservado en una colección de cultivo. Debe notificar al gestor técnico cualquier falla en alguna de las unidades de la colección de cultivos. Tiene comunicación directa con el gestor técnico y el curador |
Gestor adminis- trativo | Se encarga de atender y gestionar las necesidades del personal y de los clientes en los ámbitos administrativos y de gestión de calidad. Tiene comunicación directa con los clientes, el gestor de calidad, el curador y documentador. |
Gestor de calidad | Está a cargo de la elaboración y actualización de los procedimientos documentados, de coordinar las auditorías internas y la supervisión de la implementación de las oportunidades, mejoras, acciones preventivas y acciones correctivas. Tiene comunicación directa con el curador, técnico y gestor administrativo y con el encargado de documentación. |
Encargado de documen-tación | Es quien ordena la información, tanto física como digital, y realiza los respaldos de forma periódica. También es el encargado de mantener el sitio web del cepario. Tiene comunicación directa con el curador, gestor de la calidad y gestor administrativo. |
El curador es el responsable de organizar y mantener la colección de cultivos y de dirigir a un grupo de personas entre los cuales está el gestor técnico y el técnico de laboratorio, quienes se encargan de ejecutar los procedimientos establecidos para el funcionamiento de la colección.
A su vez, dependen del curador las personas en labores administrativas como el área de gestión administrativa y gestión de calidad. Si los recursos económicos disponibles no permiten contratar una persona en cada uno de los cargos señalados, se pueden compartir labores entre las personas que estén disponibles, teniendo presente que una de las principales tareas en una colección de cultivos es mantener el orden y seguimiento de los procesos que en ella se realizan.
Instrumentos y equipos utilizados en el Cepario
El ultracongelador es una de las principales herramientas utilizadas en los laboratorios de investigación. El ultracongelador protege las muestras biológicas manteniéndolas a temperaturas muy bajas en el orden de -80 °C.
Es una herramienta que permite avistar elementos que no pueden observarse o son invisibles a simple vista, a través de lentes, visores y rayos de luz que acercan o agrandan la imagen en escalas convenientes para su examinación y análisis.
Una incubadora es un dispositivo que se utiliza para cultivar y mantener cultivos microbiológicos o cultivos celulares. La incubadora mantiene una temperatura, humedad y otros parámetros tales como el contenido de CO2 y oxígeno de la atmósfera interior en valores óptimos.
Es un instrumento que se emplea para poder tener ambientes libres de contaminación, debido a que logra proporcionar aire descontaminado proveniente de partículas de hasta 0.1 micras.
Las micropipetas son un instrumento básico en el laboratorio, imprescindible para tomar y dispensar pequeños volúmenes de líquidos de manera precisa.
Fabricadas en polipropileno de elevada pureza y sin cadmio. Poseen alta transparencia y un óptimo grado hidrorrepelente para reducir al mínimo la retención de líquidos y soluciones en las paredes internas.
Los crioviales se utilizan comúnmente para el almacenamiento criogénico de materiales biológicos utilizando nitrógeno líquido.
Las puntas para micropipeta se utilizan para tomar una pequeña muestra de líquido o solución, utilizada principalmente en laboratorios e investigación. Fabricadas con polipropileno. Ideales para laboratorios de microbiología y biología molecular.
Son piezas rectangulares de vidrio transparente que permiten fijar muestras para ser observadas a través del microscopio. Elaboradas de vidrio de alta calidad que permite realizar observaciones claras y con bordes suaves para evitar cortes en el usuario.
Las laminillas se utilizan para cubrir la suspensión de células en la cámara de recuento. Se coloca la laminilla en los soportes exteriores y la estructura plana de las superficies causa que la laminilla se adhiera bien.
En las Tablas 2 y 3 se muestra el costo de los diferentes materiales y equipos descritos con anterioridad, respectivamente. Estos costos son mostrados tanto en dulares estadounidenses (USD) como en pesos cubanos (CUP).
Tabla 2
Costo de los materiales a utilizar en el cepario
Materiales | Costo en USD | Costo en CUP |
Micropipetas 10 µl y 100 µl – 1000 µl | $ 41,99 | $ 5 038,8 |
Puntas azules | $ 7,98 | $ 957,6 |
Crioviales | $ 8,5 | $ 1 020 |
Puntas amarillas | $ 9,99 | $ 1 198,8 |
Láminas portaobjetos para microscopía | $ 14,99 | $ 1 798,8 |
Laminillas cubreobjetos para microscopía | $ 9,76 | $ 1 171,2 |
Tabla 3
Costo de los equipos a emplear en el cepario
Equipos | Costo en USD | Costo en CUP |
Ultracongeladores -80 °C | $ 5155,65 | $ 618 678 |
Microscopio óptico | $ 266,87 | $ 32 024,4 |
Incubadora | $ 405,9 | $ 48 708 |
Cabina de flujo laminar | $ 719,4 | $ 86 328 |
Para el cepario de hongos se expone una serie de procedimientos claramente definidos para su ade-cuado funcionamiento con el fin de llevar a cabo de manera clara, organizada y definida las actividades que se desarrollan. La correcta implementación de la documentación necesaria define la forma sobre cómo desempeñar organizada y estructuradamente los procesos para la mejora en los procedimientos y actividades que se llevan a cabo dentro del cepario por parte del personal encargado.
El procedimiento operativo estándar documenta de forma detallada la elaboración de procedimientos que se realizan en un laboratorio, no solo con el fin de garantizar la calidad de los mismos, sino también la reproducibilidad, la homogeneidad y la estandarización de las actividades que forman parte del procedimiento, con el fin de evitar fallas y garantizar la correcta elaboración.
3.1. Procedimiento Operativo Estándar (P.O.E)
3.1.1. Reactivación de cepas del banco primario y verificación de pureza.
Objetivo: Ejecutar procedimientos para llevar a cabo la correcta reactivación de cepas de hongos, cumpliendo con procedimientos (Tabla 4) para su manipulación, que garanticen su pureza y viabilidad posterior a su reactivación.
Tabla 4
Descripción del procedimiento
No. | Descripción | Responsable | |
Unidad | Cargo | ||
1. | Siembra en los medios de cultivos determinados para cada uno de los microorganismos haciendo uso de la cabina de flujo laminar. | Cepario de Hongos | Profesional I |
2. | Utilizando la incubadora, incubar a 25 °C. | Cepario de hongos | Profesional I |
3. | Dejar por un período de una hora, una caja con medio abierta e incubar a 25 °C. | Cepario de hongos | Profesional I |
4. | Incubar el medio seleccionado a una temperatura de 25 °C, sin realizar siembra y observar cada 24 horas. | Cepario de hongos | Profesional I |
5. | Revisar la siembra cada día (12 h), para verificar que no haya contaminación de tipo bacteria u hongo. | Cepario de hongos | Profesional I |
6. | Observar las características decrecimiento visibles, en la caja de Petri. | Cepario de hongos | Profesional I |
Alcance: Es aplicable a cepas de hongos conservados y que forman parte del banco primario del cepario de hongos de la Universidad de Camagüey.
Definiciones
Banco de referencia: Lote de cultivos idénticos obtenido en el laboratorio por un simple subcultivo a partir de una cepa de referencia obtenida en el laboratorio o a partir de un proveedor (Burgos, 2014).
Pureza: Es la determinación garantizada por medio de repiques sucesivos en diferentes medios de cultivos, con el fin de asegurar que el microor-ganismo está en un cultivo puro.
Viabilidad: Es la capacidad de un microorganismo de multiplicarse en un medio sólido. Esto implica el uso de diferentes métodos en donde se evalúa de forma cualitativa el crecimiento de un microorganismo sobre Agar durante un período de tiempo o de forma cuantitativa determinando en cantidades la concentración del mismo (Giraldo et al., 2012).
Fundamento: Este procedimiento se fundamenta en la aplicación de metodologías estandarizadas para la reactivación de cepas de hongos que pertenecen al cepario de hongos.
Frecuencia: Este procedimiento se deberá realizar cuando se realice la reactivación y verificación de pureza y viabilidad de las cepas de hongos, por lo menos una vez al año.
Materiales: Criotubos estériles; Láminas porta objetos para microscopía; Laminillas cubre objetos para microscopía.
Equipos: Cabina de flujo laminar; Microscopio; Micropipetas graduadas; Incubadora.
3.1.2. Siembras para docencia
Objetivo: Realizar un procedimiento estandarizado (Tabla 5) para la manipulación del material con fines de prestar servicios de docencia, solicitado por cada una de las asignaturas que necesitan cepas de hongos en la Universidad de Camagüey.
Alcance: Va dirigido a cada una de las asignaturas dictadas en la Universidad de Camagüey que requieran el uso de cepas de hongos para su manipulación con fines de docencia.
Definiciones:
Hongos: Microorganismo eucariota, unicelulares o pluricelulares y presentan nutrición por absorción. Su reproducción se da por micelio, esporas o conidios. Capaces de realizar diferentes procesos de bioremediación en la naturaleza por la segregación de enzimas (Burgos, 2014).
Docencia: Hace referencia a la actividad que promueve conocimiento, ejecutado por un docente capaz de llevar a cabo diferentes actividades de acumulación de diversos saberes enfocándose en establecer conocimiento y enseñanza al estudiante, mediante procesos educativos y de información garantizada (Burgos, 2014).
Fundamento: Dicho procedimiento se basa en la correcta manipulación de cada una de las cepas que se encuentran en el cepario de hongos, garantizando la utilización de las mismas en fines de docencia que conlleven a responder a las necesidades solicitadas por el docente a cargo, para brindar bases confiables y visibles en la educación de los estudiantes.
Tabla 5
Descripción del procedimiento
No. | Descripción | Responsable | |
Unidad | Cargo | ||
1. | Realizar un cronograma, con el fin de realizar la programación de siembras. | Cepario de hongos | Monitor |
2. | Recepción del material solicitado a monitoría, utilizado en actividades de docencia y solicitado con anterioridad. | Cepario de hongos | Monitor |
3. | Utilizando la cabina de flujo laminar se realizan las siembras programadas. Se debe sembrar con al menos 15 días de anterioridad, o de acuerdo a los requerimientos del docente. | Cepario de hongos | Monitor |
4. | Incubar a 25°C haciendo uso de la incubadora, así mismo realizar controles de calidad del funcionamiento de la incubadora y de los medios de cultivos utilizados con el fin de garantizar la pureza del cultivo. | Cepario de hongos | Monitor |
5. | Evaluar que las características propias de las cepas solicitadas se mantengan durante el período de incubación. | Cepario de hongos | Monitor |
6. | Garantizar la pureza de la cepa y sus características mediante las características macroscópicas y el montaje de láminas para microscopía. | Cepario de hongos | Monitor |
7. | Empacar las cepas solicitadas para ser utilizadas con fines de docencia y almacenar a temperatura ambiente hasta el momento de la entrega. | Cepario de hongos | Monitor |
8. | Con ayuda de un formato de registro, realizar la entrega de las cepas solicitadas a la persona encargada que designe el profesor para recogerlas. | Cepario de hongos | Monitor |
Frecuencia: Este procedimiento se debe realizar cada vez que se requiera prestar un servicio de docencia donde se solicite material proveniente del cepario de hongos.
Materiales:
Equipos:
3.1.3. Confirmación de pureza en cepas de hongos
Objetivo: Este procedimiento (Tabla 6) tiene como fin garantizar la pureza de cepas de hongos de la Universidad de Camagüey, mediante la utilización de claves taxonómicas, y pruebas bioquímicas, determi-nando que la cepa evaluada esté correctamente identificada, caracterizada y libre de contaminantes de tipo bacteria y/o hongo.
Alcance: Está diseñado para ser utilizado en cepas de hongos del cepario de hongos de la Universidad de Camagüey que sean utilizados en cualquier actividad prestada por este.
3.2. Definiciones
Clave taxonómica: Hace referencia a un procedi-miento metodológico que guía en la identificación y caracterización de una especie según su morfología tanto microscópica como macroscópica, dando a conocer de manera establecida y adecuada según la información necesaria y obtenida en una investiga-ción que se haya realizado previamente, que garan-tice la caracterización correcta de especie a analizar (Burgos, 2014).
Fundamento: Se fundamenta en el uso de técnicas, metodologías estandarizadas, material educativo y de investigación para la verificación de pureza en cepas de hongos que pertenecen al cepario de hongos.
Frecuencia: El procedimiento de verificación de pureza deberá ser aplicado a las cepas de hongos que pertenezcan al cepario de hongos, antes de ser entregados como servicios de docencia y/o investigación, o cuando se realice una metodología de conservación de la cepa o una vez al año como verificación del funcionamiento del banco de conservación.
Materiales
Equipos
Tabla 6
Descripción del procedimiento
No. | Descripción | Responsable | |
Unidad | Cargo | ||
1. | Siembra en los medios de cultivos determinados para cada uno de los microorganismos, haciendo uso de la cabina de flujo laminar. | Cepario de hongos | Profesional I |
2. | Incubar a 25 °C por 7 días. | Cepario de hongos | Profesional I |
3. | Dejar por un período de una hora, una caja con medio abierta en la cabina de flujo laminar e incubar a 25 °C, con el fin de realizar controles de calidad de la cabina de flujo laminar. | Cepario de hongos | Profesional I |
4. | Incubar el medio seleccionado a una temperatura de 25 °C, sin realizar siembra y observar cada 24 horas, para realizarle controles de calidad a los medios de cultivos utilizados. | Cepario de hongos | Profesional I |
5. | Revisar la siembra cada día (12 horas), para verificar pureza periódicamente, durante su período de incubación y garantizar que no haya contaminación de tipo bacteria u hongo. | Cepario de hongos | Profesional I |
6. | Realizar una caracterización macroscópica detallada del crecimiento en cada uno de los medios replicados con el fin de identificar que el crecimiento sea homogéneo de un medio al otro. | Cepario de hongos | Profesional I |
3.3. Mantenimiento del banco de trabajo de las cepas de hongos
Objetivo: Realizar procedimientos para llevar a cabo el correcto mantenimiento de cepas de hongos del banco primario del cepario de hongos de la Universidad de Camagüey, con el fin de garantizar el correcto funcionamiento, mediante el cumplimiento de procedimientos para su manipulación (Tabla 7), que garanticen su pureza y viabilidad.
Alcance: Es aplicable a cepas de hongos que formen parte del banco primario del cepario de hongos de la Universidad de Camagüey.
Definiciones:
Pureza: Es la determinación garantizada por medio de repiques sucesivos en diferentes medios de cultivos, con el fin de asegurar que el microor-ganismo está en un cultivo puro.
Banco de referencia: Lote de cultivos idénticos obtenido en el laboratorio por un simple subcultivo a partir de una cepa de referencia obtenida en el laboratorio o a partir de un proveedor (Burgos, 2014).
Tabla 7
Descripción del procedimiento
No. | Descripción | Responsable | |
Unidad | Cargo | ||
1. | Siembras periódicas (6 a 12 meses), en los medios de cultivos determinados para cada uno de los microorganismos haciendo uso de la cabina de flujo laminar. | Cepario de hongos | Profesional I |
2. | Incubar a 25 °C por 7 días para que la cepa desarrolle su óptimo crecimiento. | Cepario de hongos | Profesional I |
3. | Dejar por un periodo de una hora una caja con medio abierta en la cabina de flujo laminar e incubar a 25°C, con el fin de realizar controles de calidad de la cabina de flujo laminar. | Cepario de hongos | Profesional I |
4. | Incubar el medio seleccionado a una temperatura de 25°C, sin realizar siembra y observar cada 24 horas, para realizarle controles de calidad a los medios de cultivos utilizados. | Cepario de hongos | Profesional I
|
5. | Observar las características macroscópicas de crecimiento visibles, en la caja de Petri. | Cepario de hongos | Profesional I |
6. | Uso de claves taxonómicas con el fin de verificar la pureza de la cepa evaluada. | Cepario de hongos | Profesional I |
7. | Realizar procedimientos de conservación. | Cepario de hongos | Profesional I |
Hongos: Microorganismo eucariota, unicelulares o pluricelulares y presentan nutrición por absorción. Su reproducción se da por micelio, esporas o conidios. Capaces de realizar diferentes procesos de bioremediación en la naturaleza por la segregación de enzimas (Burgos, 2014).
Fundamento: Este procedimiento se fundamenta en la correcta manipulación de las cepas de hongos, con el fin de mantener su pureza y viabilidad y de garantizar un correcto funcionamiento del cepario de hongos
Frecuencia: El procedimiento del mantenimiento de cepas del banco primario deberá ser aplicado a las cepas de hongos que pertenezcan al cepario de hongos, de forma periódica (cada 6 a 12 meses) para garantizar la pureza y viabilidad de las cepas que pertenezcan al cepario de hongos con el fin de llevar un correcto funcionamiento del banco de trabajo.
Materiales:
Equipos:
3.4. Conservación por congelación de hongos filamentosos pertenecientes a la colección de microorganismos del cepario de hongos
Objetivo: Determinar procedimientos para la conser-vación de hongos filamentosos (Tabla 8) pertene-cientes al cepario de hongos de la Universidad de Camagüey.
Alcance: Este Procedimiento Operativo Estándar se diseñó con la finalidad de realizar la conservación de hongos filamentosos que pertenecen al cepario de hongos de la Universidad de Camagüey.
Definiciones:
Conservación: Hace referencia al mantenimiento de cepas por períodos de tiempos a corto, mediano y largo plazo, con el fin de preservar una colección de microorganismos a través del tiempo. La elección del método de conservación está ligada a diferentes factores que garantizan la pureza, la viabilidad y estabilidad de la misma. Con el fin de detener el crecimiento de las células del microorganismo conservado, pero sin detener su metabolismo. Existen diferentes tipos de conservación; entre los que se encuentra como método de conservación a largo plazo, la congelación, que utiliza un crio conservante como el glicerol evitando el daño a la célula producida durante la congelación (Burgos, 2014).
Fundamento: Se fundamenta en la aplicación de técnicas estandarizadas de conservación por congelación de hongos filamentosos que garanticen su mantenimiento a través del tiempo, teniendo en cuenta la viabilidad del microorganismo, la pureza, y la estabilidad genética de la célula.
Frecuencia: Este procedimiento se debe llevar a cabo cada vez que se realice la conservación por congelación para cepas de hongos filamentosos.
Materiales:
Equipos:
Tabla 8
Descripción del procedimiento
No. | Descripción | Responsable | ||
| Unidad | Cargo | ||
1. | Siembra por punción central del hongo filamentoso en las cajas con el Agar seleccionado. | Cepario de Hongos | Profesional I | |
2. | Incubar por 7 días a 25 °C | Cepario de Hongos | Profesional I | |
3. | Verificar las características microscópicas | Cepario de Hongos | Profesional I | |
4. | Verificar características macroscópicas. | Cepario de Hongos | Profesional I | |
5. | Pasados los días de incubación del hongo y con ayuda de una punta amarilla realizar perforaciones del Agar. | Cepario de Hongos | Profesional I | |
6. | Transferir 4 discos a cada crioviales con 1 ml de agua destilada con glicerol al 20%. | Cepario de Hongos | Profesional I | |
7. | Congelar los crioviales a – 80° C. | Cepario de Hongos | Profesional I | |
8. | Evaluación de la viabilidad y de la pureza del método de conservación mediante la siembra de los discos en diferentes medios de cultivos. | Cepario de Hongos | Profesional I | |
3.5. Descripción de la encuesta aplicada
La encuesta (Apéndice) fue realizada a un total de dos informantes claves: a la responsable del cepario del Instituto de Sanidad Vegetal de Camagüey y a la Directora del Centro de Estudios de Biotecnología Industrial (CEBI). Sus opiniones, comentarios y observaciones acerca de los manejos generales del cepario arrojaron los siguientes resultados:
En cuanto a la formación académica y especialización relacionada con microbiología y cultivo de hongos se constató que una de ellas es Ingeniera Agrónoma, especialista principal en el área de producción de hongos Entomopatógenos, Beauberiabassiana, Lecanicillium Lecani, Metarhizium anisoplae y Trichoderma viridae y Harzianum. Esta área tiene como labor fundamental el control biológico, el cual es un método de control de plagas y enfermedades que consiste en utilizar organismos vivos como objeto con el fin de controlar las poblaciones de otros organismos siendo un componente importante del control integrado de plagas. La otra investigadora no posee una formación relacionada con la micro-biología.
Con respecto a la selección de los métodos utilizados para cultivar y mantener microorganismos especial-mente Pleurotus ssp, ambas coincidieron que el método más utilizado es la resiembra continua.
Ambas investigadoras están realizando investiga-ciones relacionadas con microorganismos tales como Pleurotus ssp.
Los desafíos más comunes que enfrentan en su trabajo diario con microorganismos y Pleurotus spp son: la dificultad para mantener el cepario por falta de cepas madres y los medios de cultivos caducados que limitan la conservación de estas cepas para continuar su producción, quienes tienen como papel principal los Centros de Reproducción de Entomo-patógenos (CREE) entidad que tiene como objetivo final la aplicación de dichos microorganismos al cultivo para su control biológico.
Otros desafíos a los que se enfrentan es el de garantizar la viabilidad, pureza y las propiedades biotecnológicas de las cepas conservadas en la colección, empleando métodos de conservación adecuados a corto, mediano y largo plazo. Además de contar con los recursos necesarios y conocer las peculiaridades de las diferentes técnicas de preservación existentes para su correcta aplicación.
Las investigadoras aluden que las consideraciones éticas al trabajar con microorganismos y Pleurotus spp deben ser: tener responsabilidad en el trabajo, guardar la estricta confidencialidad de los datos provenientes de las instituciones y de los investigadores de las cuales proceden las cepas, mostrar preocupación por el interés del individuo ya que debe siempre prevalecer sobre los intereses de la ciencia y la sociedad, con el debido protocolo de bioseguridad según la Organización Mundial de la Salud (OMS) en la protección del personal técnico del laboratorio. Estas especialistas consideran como recursos imprescindibles para trabajar en el cepario: placa de Petri, tubos de ensayos, medios de cultivos sólidos y líquidos en caso de hongos filamentosos (Agar Extracto Malta, Agar Papa Dextrosa, Agar Dextrosa Sabouraud, Caldo Extracto Malta, Caldo Dextrosa Sabouraud), algodón, gasa, portaobjetos, cubreobjetos, asa y aguja de siembra, mechero Bunsen, agua destilada, rotulador permanente, microscopio óptico, estereoscopio, guantes de látex, incubadora, campana de flujo laminar, autoclave, alcohol al 90%.
Las especialistas plantearon como aspectos gratifi-cantes que a pesar de todos los retos y dificultades que enfrentan a diario, es una especialidad que le enseña cada día algo nuevo. Los aspectos que más le gratifican de trabajar en el cepario son: la repro-ducción de las cepas por si solas, con poca tecnología, a bajos costos, sin dejar residuos tóxicos ni contaminar al medio ambiente. El apoyo que aporta a la formación de estudiantes de pregrado y posgrado, mediante la interacción con los mismos en el desarrollo de técnicas microbiológicas en el laboratorio, lo que ha contribuido a la defensa exitosa de trabajos de curso, tesis de diploma, tesis de maestría y doctorados.
4. Conclusiones
Se diseña, describe y propone, a partir de una revisión bibliográfica exhaustiva, la estructura documental para implementar los procedimientos operativos estándar con vistas a la futura edificación de un cepario de hongos de la Universidad de Camagüey, con el fin de realizar el mantenimiento y conservación de las cepas de hongos comestibles. Se presentan y describen los materiales y equipamiento que debe poseer o necesitar un cepario, para su futura implementación en la Universidad de Camagüey.
Los procedimientos operativos estándar elaborados para la preservación de microorganismos en el futuro cepario de la Universidad de Camagüey se utilizarán para la conservación de las cepas donadas por los centros de investigación que colaboran en el proyecto de investigación "Desarrollo de tecnologías para la producción de alimentos a partir de setas comestibles en la cadena agroalimentaria" perteneciente al Programa Territorial de Alimento Humano: Producción sostenible de alimentos con encadenamiento productivo, a implementarse en la provincia de Camagüey, Cuba.
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Apéndice
Encuesta realizada a trabajadores del cepario
La presente encuesta tiene como objetivo conocer su opinión acerca de los manejos generales de ceparios. Los resultados de la misma permitirán identificar los aspectos generales que debemos tener en cuenta para desarrollar una propuesta para la confección de un cepario en la Universidad de Camagüey Ignacio AgramonteLoynaz.
___Resiembra continua.
___Liofilización.
___ Criogenización.
___ Congelación bajo aceite mineral.
___ Congelación en agua destilada estéril.
___ Otros